Slangegift inneholder enzymer som hydrolyserer karboksylesterbindinger.Substratene for hydrolyse er fosfolipider, acetylkolin og aromatisk acetat.Disse enzymene inkluderer tre typer: fosfolipase, acetylkolinesterase og aromatisk esterase.Argininesterase i slangegift kan også hydrolysere syntetisk arginin eller lysin, men det hydrolyserer hovedsakelig proteinpeptidbindinger i naturen, så det tilhører protease.Enzymene som er omtalt her virker kun på estersubstrater og kan ikke virke på noen peptidbinding.Blant disse enzymene er de biologiske funksjonene til acetylkolinesterase og fosfolipase viktigere og har blitt fullstendig studert.Noen slangegift har sterk aromatisk esteraseaktivitet, som kan hydrolysere p-nitrofenyletylester, a - eller P-naftalenacetat og indoletylester.Det er fortsatt ukjent om denne aktiviteten er produsert av et uavhengig enzym eller en kjent bivirkning av karboksylesterase, enn si dens biologiske betydning.Når giften til Agkistrodon halys Japonicus ble reagert med p-nitrofenyletylester og indoletylester, ble hydrolysatene av p-nitrofenol og indolfenol ikke funnet;Tvert imot, hvis disse esterne reagerer med cobra Zhoushan-underarten slangegift og Bungarus multicinctus slangegift, vil de raskt hydrolyseres.Det er kjent at disse kobragiftene har sterk kolinesteraseaktivitet, som kan være ansvarlig for hydrolyse av de ovennevnte substratene.Faktisk, Mclean et al.(1971) rapporterte at mange slangegift som tilhører Cobra-familien kan hydrolysere indoletylester, naftalenetylester og butylnaftalenester.Disse slangegiftene kommer fra: kobra, svarthalset kobra, svartleppet kobra, gylden kobra, egyptisk kobra, kongekobra, gylden kobra mamba, svart mamba og hvitleppet mamba (D. aw kjenner fortsatt østlig rhombola klapperslange
Slangegiften kan hydrolysere metylindoletylester, som er substratet for å bestemme kolinesteraseaktiviteten i serum, men denne slangegiften viser ikke kolinesteraseaktivitet.Dette viser at det er en ukjent esterase i kobragift, som er forskjellig fra kolinesterase.For å forstå naturen til dette enzymet, er det nødvendig med ytterligere separasjonsarbeid.
1, Fosfolipase A2
(I) Oversikt
Fosfolipase er et enzym som kan hydrolysere glyserylfosfat.Det er 5 typer fosfolipaser i naturen, nemlig fosfolipase A2 og fosfolipase
A. , fosfolipase B, fosfolipase C og fosfolipase D. Slangegiften inneholder hovedsakelig fosfolipase A2 (PLA2), noen få slangegift inneholder fosfolipase B, og andre fosfolipaser finnes hovedsakelig i dyrevev og bakterier.Fig. 3-11-4 viser virkningsstedet til disse fosfolipasene på substrathydrolyse.
Blant fosfolipaser har PLA2 blitt studert mer.Det kan være det mest studerte enzymet i slangegift.Substratet er esterbindingen på den andre posisjonen til Sn-3-glyserofosfat.Dette enzymet er mye funnet i slangegift, biegift, skorpiongift og dyrevev, og PLA2 er rikelig i fire familieslangegifter.Fordi dette enzymet bryter røde blodceller og forårsaker hemolyse, kalles det også "hemolysin".Noen kaller også PLA2 hemolytisk lecitinase.
Ludeeke fant først ut at slangegift kan produsere en hemolytisk forbindelse ved å virke på lecitin gjennom enzymer.Senere har Delezenne et al.bevist at når kobragift virker på hesteserum eller eggeplomme, danner det en hemolytisk substans.Det er nå kjent at PLA2 kan virke direkte på fosfolipidene i erytrocyttmembranen, ødelegge strukturen til erytrocyttmembranen og forårsake direkte hemolyse;Det kan også virke på serum eller tilsatt lecitin for å produsere hemolytisk lecitin, som virker på røde blodceller for å produsere indirekte hemolyse.Selv om PLA2 er rikelig i de fire familiene av slangegift, er innholdet av enzymer i ulike slangegift litt forskjellig.klapperslange (C
Slangegift viste kun svak PLA2-aktivitet.Tabell 3-11-11 illustrerer sammenligningen av PLA2-aktivitet til 10 hovedgifter fra giftslanger i Kina.
Tabell 3-11-11 Sammenligning av fosfolipase VIII-aktiviteter til 10 slangegift i Kina
Slangegift
Fettfrigjøring
alifatisk syre,
Cjumol/mg)
Hemolytisk aktivitet CHU50/^ g * ml)
Slangegift
Frigjør fettsyrer
(^raol/mg)
Hemolytisk aktivitet "(HU50/ftg * 1111)
Najanaja atra
9. 62
elleve
Micracephal ophis
fem komma én null
kalyspallas
8. 68
to tusen og åtte hundre
gracilis
V, akutus
7. 56
* * #
Ophiophagus hannah
tre komma åtte to
hundre og førti
Bnugarus fasctatus
7,56
to hundre og åtti
B. multicinctus
ett komma ni seks
to hundre og åtti
Viper a russelli
sju komma null tre
T, mucrosquamatus
ett komma åtte fem
Siamensis
T. stejnegeri
0, 97
（2） Separasjon og rensing
Innholdet av PLA2 i slangegift er stort, og det er stabilt overfor varme, syre, alkali og denatureringsmiddel, slik at det er enkelt å rense og separere PLA2.Den vanlige metoden er å først utføre gelfiltrering på rågiften, deretter utføre ionebytterkromatografi, og neste trinn kan gjentas.Det skal bemerkes at frysetørking av PLA2 etter ionebyttekromatografi ikke bør forårsake aggregering, fordi frysetørkeprosessen ofte øker ionestyrken i systemet, som er en viktig faktor som forårsaker aggregering av PLA2.I tillegg til de generelle metodene ovenfor, har følgende metoder også blitt tatt i bruk: ① Wells et al.② Substratanalogen til PLA2 ble brukt som ligand for affinitetskromatografi.Denne liganden kan binde seg til PLA2 i slangegift med Ca2+.EDTA brukes mest som elueringsmiddel.Etter at Ca2+ er fjernet, reduseres affiniteten mellom PLA2 og ligand, og den kan dissosieres fra ligand.Andre bruker 30 % organisk løsning eller 6mol/L urea som elueringsmiddel.③ Hydrofob kromatografi ble utført med PheiiylSephar0SeCL-4B for å fjerne spor av PLA2 i kardiotoksin.④ Anti-PLA2-antistoff ble brukt som ligand for å utføre affinitetskromatografi på PLA2.
Så langt har et stort antall slangegift PLAZ blitt renset.Tu et al.(1977) listet opp PLA2 renset fra slangegift før 1975. De siste årene er det rapportert om et stort antall artikler om separasjon og rensing av PLA2 hvert år.Her fokuserer vi på separasjon og rensing av PLA av kinesiske lærde.
Chen Yuancong et al.(1981) skilte tre PLA2-arter fra giften til Agkistrodon halys Pallas i Zhejiang, som kan deles inn i sur, nøytral og alkalisk PLA2 i henhold til deres isoelektriske punkter.I henhold til sin toksisitet er nøytral PLA2 mer giftig, som har blitt identifisert som presynaptisk nevrotoksin Agkistrodotoksin.Alkalisk PLA2 er mindre giftig, og sur PLA2 har nesten ingen toksisitet.Wu Xiangfu et al.(1984) sammenlignet egenskapene til tre PLA2-er, inkludert molekylvekt, aminosyresammensetning, N-terminal, isoelektrisk punkt, termisk stabilitet, enzymaktivitet, toksisitet og hemolytisk aktivitet.Resultatene viste at de hadde lignende molekylvekt og termisk stabilitet, men hadde signifikante forskjeller i andre aspekter.Når det gjelder enzymaktivitet, var sur enzymaktivitet høyere enn alkalisk enzymaktivitet;Den hemolytiske effekten av alkalisk enzym på røde blodceller fra rotter var sterkest, etterfulgt av nøytralt enzym, og surt enzym ble knapt hemolysert.Derfor spekuleres det i at den hemolytiske effekten av PLAZ er relatert til ladningen til PLA2-molekylet.Zhang Jingkang et al.(1981) har laget Agkistrodotoxin-krystaller.Tu Guangliang et al.(1983) rapporterte at en giftig PLA med et isoelektrisk punkt på 7,6 ble isolert og renset fra giften til Vipera rotundus fra Fujian, og dens fysiske og kjemiske egenskaper, aminosyresammensetning og sekvensen av 22 aminosyrerester ved N. -terminal ble bestemt.Li Yuesheng et al.(1985) isolerte og renset en annen PLA2 fra giften til Viper rotundus i Fujian.Underenheten til PLA2 * er 13 800, det isoelektriske punktet er 10,4, og den spesifikke aktiviteten er 35/xnioI/miri mg。 Med lecitin som substrat er den optimale pH-verdien til enzymet 8,0 og den optimale temperaturen er 65 °C LD5 injisert intravenøst i mus.Det er 0,5 ± 0,12 mg/kg.Dette enzymet har åpenbare antikoagulerende og hemolytiske effekter.Det giftige PLA2-molekylet består av 123 rester av 18 typer aminosyrer.Molekylet er rikt på cystein (14), asparaginsyre (14) og glycin (12), men inneholder bare ett metionin, og dets N-terminale er serinrest.Sammenlignet med PLA2 isolert av Tuguang er molekylvekten og antall aminosyrerester til de to isoenzymene veldig like, og aminosyresammensetningen er også veldig lik, men antallet asparaginsyre- og prolinrester er noe forskjellig.Guangxi king cobra slangegift inneholder rik PLA2.Shu Yuyan et al.(1989) isolerte en PLA2 fra giften, som har en spesifikk aktivitet 3,6 ganger høyere enn den opprinnelige giften, en molekylvekt på 13000, en sammensetning på 122 aminosyrerester, et isoelektrisk punkt på 8,9 og god termisk stabilitet.Fra elektronmikroskopobservasjonen av effekten av grunnleggende PLA2 på røde blodlegemer, kan det sees at det har åpenbar effekt på menneskets røde blodcellemembran, men har ingen åpenbar effekt på røde blodceller fra geit.Denne PLA2 har åpenbar retardasjonseffekt på den elektroforetiske hastigheten til røde blodceller hos mennesker, geiter, kaniner og marsvin.Chen et al.Dette enzymet kan hemme blodplateaggregering indusert av ADP, kollagen og natriumarachidonsyre.Når PLA2-konsentrasjonen er 10/xg/ml~lOOjug/ml, hemmes blodplateaggregeringen fullstendig.Hvis vaskede blodplater ble brukt som materialer, kunne ikke PLA2 hemme aggregering ved en konsentrasjon på 20 mg/ml.Aspirin er en hemmer av cyklooksygenase, som kan hemme effekten av PLA2 på blodplater.PLA2 kan hemme blodplateaggregering ved å hydrolysere arakidonsyre for å syntetisere tromboksan A2.Løsningskonformasjonen av PLA2 produsert av Agkistrodon halys Pallas gift i Zhejiang-provinsen ble studert ved hjelp av sirkulær dikroisme, fluorescens og UV-absorpsjon.De eksperimentelle resultatene viste at hovedkjedekonformasjonen til dette enzymet var lik den til samme type enzym fra andre arter og slekter, skjelettkonformasjonen hadde god varmebestandighet, og den strukturelle endringen i surt miljø var reversibel.Kombinasjonen av aktivator Ca2+ og enzym påvirker ikke miljøet av tryptofanrester, mens inhibitoren Zn2+ gjør det motsatte.Måten pH-verdien til løsningen påvirker enzymaktiviteten på er forskjellig fra de ovennevnte reagensene.
I prosessen med PLA2-rensing av slangegift er et åpenbart fenomen at en slangegift inneholder to eller flere PLA2-elueringstopper.Dette fenomenet kan forklares som følger: ① på grunn av eksistensen av isozymer;② Én type PLA2 polymeriseres til en rekke PLA2-blandinger med forskjellige molekylvekter, hvorav de fleste er i området 9 000~40 000;③ Kombinasjonen av PLA2 og andre slangegiftkomponenter kompliserer PLA2;④ Fordi amidbindingen i PLA2 hydrolyseres, endres ladningen.① Og ② er vanlige, med bare noen få unntak, slik som PLA2 i CrWa/w slangegift
Det er to situasjoner: ① og ②.Den tredje tilstanden er funnet i PLA2 i giften til følgende slanger: Oxyranus scutellatus, Parademansia microlepidota, Bothrops a ^>er, palestinsk hoggorm, sandhoggorm og forferdelig klapperslange km.
Resultatet av tilfelle ④ gjør at migrasjonshastigheten til PLA2 endres under elektroforese, men aminosyresammensetningen endres ikke.Peptider kan brytes ved hydrolyse, men generelt er de fortsatt bundet sammen av disulfidbindinger.Giften til den østlige klapperslangen inneholder to former for PLA2, kalt henholdsvis type a og type p PLA2.Forskjellen mellom disse to typene PLA2 er bare en aminosyre, det vil si at glutamin i ett PLA2-molekyl erstattes av glutaminsyre i det andre PLA2-molekylet.Selv om den eksakte årsaken til denne forskjellen ikke er klar, antas det generelt at det er relatert til deaminering av PLA2.Hvis PLA2 i den palestinske hoggormgiften holdes varm med rågiften, vil endegruppene i enzymmolekylene bli flere enn før.Fra C har PLA2 isolert fra slangegift to forskjellige N-terminaler, og dens molekylvekt er 30 000. Dette fenomenet kan være forårsaket av den asymmetriske dimeren til PLA2, som ligner på den symmetriske dimeren som dannes av PLA2 i giften til den østlige diamondback klapperslange og western diamondback klapperslange.Den asiatiske kobraen er sammensatt av mange underarter, hvorav noen ikke er veldig klare i klassifiseringen.For eksempel er det som tidligere ble kalt Cobra Outer Caspian-underarten nå anerkjent
Det bør tilskrives Cobraen fra det ytre Kaspiske hav.Ettersom det er mange underarter og de er blandet sammen, varierer sammensetningen av slangegift mye på grunn av ulike kilder, og innholdet av PLA2 isozymer er også høyt.For eksempel kobragift
Minst 9 typer PLA2-isozymer av r ^ ll-arter ble funnet i, og 7 typer PLA2-isozymer ble funnet i giftet til kobra-underarten Caspian.Durkin et al.(1981) studerte PLA2-innholdet og antall isozymer i forskjellige slangegifter, inkludert 18 kobragifter, 3 mambagifter, 5 huggormgifter, 16 klapperslangegifter og 3 havslangegifter.Generelt er PLA2-aktiviteten til kobragift høy, med mange isozymer.PLA2-aktiviteten og isozymene til huggormgift er middels.PLA2-aktiviteten til mambagift og klapperslangegift er svært lav eller ingen PLA2-aktivitet.PLA2-aktiviteten til sjøslangegift er også lav.
De siste årene har det ikke blitt rapportert at PLA2 i slangegift eksisterer i form av aktiv dimer, slik som den østlige rhombophora klapperslangen (C. slangegift inneholder type a og type P PLA2, som begge er sammensatt av to identiske underenheter , og bare dimerase har
Aktivitet.Shen et al.foreslo også at bare dimeren til PLA2 av slangegiften er den aktive formen av enzymet.Studiet av romlig struktur beviser også at PLA2 av western diamondback klapperslange eksisterer i form av dimer.Fisketende blanding
Det er to forskjellige PLA ^ Ei og E2 av slangegift, der 仏 eksisterer i form av dimer, dimeren er aktiv og dens dissosierte monomer er inaktiv.Lu Yinghua et al.(1980) studerte videre de fysiske og kjemiske egenskapene og reaksjonskinetikken til E. Jayanthi et al.(1989) isolerte en grunnleggende PLA2 (VRVPL-V) fra huggormgiften.Molekylvekten til monomeren PLA2 er 10000, som har dødelige, antikoagulerende og ødemeffekter.Enzymet kan polymerisere polymerer med forskjellige molekylvekter under betingelse av PH 4,8, og polymerisasjonsgraden og molekylvekten til polymerer øker med temperaturøkningen.Molekylvekten til polymeren generert ved 96 ° C er 53 100, og PLA2-aktiviteten til denne polymeren øker med to
Innleggstid: 18. november 2022